活細(xì)胞成像可用來(lái)研究周圍神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞和用于組織重建的各種生物材料之間的相互作用，不僅可看到細(xì)胞的實(shí)時(shí)快照還可看到細(xì)胞活動(dòng)。活細(xì)胞成像是現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)中最引人入勝的技術(shù)之一。

　　1、確保您擁有合適的細(xì)胞培養(yǎng)小室　　

　　首先，您需要確定哪些因素具有視覺(jué)意義。您只是想可視化您的細(xì)胞遷移嗎？或者您是否想研究您的細(xì)胞是否將遷移方向改變?yōu)樘囟ǖ纳L(zhǎng)因子？有多種細(xì)胞培養(yǎng)室可用于活細(xì)胞成像，特別是ibidi提供了各種*適合您需求的選項(xiàng)。例如， µ-Slide Chemotaxis chambers 細(xì)胞趨化載玻片（圖1）通過(guò)提供允許添加各種因素的細(xì)胞室來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)趨化性測(cè)量。細(xì)胞被接種在兩室的中間，并且可以分析細(xì)胞優(yōu)先地遷移到哪一側(cè)。大多數(shù)情況下，我們使用µ-Slide 4 Well用于我們的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈冚^大的區(qū)域允許在一個(gè)孔中觀察多個(gè)位置。另一種選擇是µ-Slide 4 Well ph+，它有一個(gè)特殊的中間擋板，可實(shí)現(xiàn)相差和熒光顯微鏡的出色圖像。有許多不同的腔室可供選用，其中有一些我們還沒(méi)有嘗試過(guò)，但將來(lái)肯定會(huì)嘗試。如果您有使用任何其他腔室載玻片的經(jīng)驗(yàn)以及如何使用它們的，請(qǐng)告知我們！

　　圖1) ibidi µ-Slide Chemotaxis

　　2、關(guān)于細(xì)胞：周密計(jì)劃您的樣品制備　　

　　接下來(lái)，重要的是要考慮如何準(zhǔn)備細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞類型、移動(dòng)速度和數(shù)量增長(zhǎng)速度，需要確定各種參數(shù)。例如，Schwann細(xì)胞需要一些時(shí)間來(lái)沉淀，因此在接種后幾小時(shí)開(kāi)始活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)是有意義的。此外，一些細(xì)胞往往會(huì)受到細(xì)胞間接觸的影響，因此重要的是要考慮正確的細(xì)胞播種數(shù)，不同的研究的對(duì)象存在差異。因此考慮不同的細(xì)胞接種數(shù)量是很重要的。最后，決定細(xì)胞是否需要額外的包被也很重要。

　　3、讓您的細(xì)胞在顯微鏡下保持活力和快樂(lè)　

　　一旦細(xì)胞準(zhǔn)備好，我們就可以去顯微成像。不幸的是，并非所有顯微鏡都可用于活細(xì)胞成像。重要的是，它們得配備一個(gè)內(nèi)置的培養(yǎng)箱，可調(diào)節(jié)CO2的濃度和溫度，以保持細(xì)胞存活。我們將奧林巴斯 IX83 與ibidi Stage Top Incubation System加熱孵育系統(tǒng)結(jié)合使用（見(jiàn)圖 2）。它為我們提供了對(duì)溫度和CO2以及濕度的精確控制。我們通常在 37°C 和 5% CO2、 50%濕度的恒定溫溫下進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。有兩種不同的加熱板可供選擇，一種用于單腔載玻片，另一種用于一次對(duì)四個(gè)腔載玻片進(jìn)行成像，非常適合大量實(shí)驗(yàn)。

　　圖2) ibidi Stage Incubation System加熱孵育系統(tǒng)

　　4、選擇合適的顯微鏡和錄制設(shè)置　　

　　把腔室載玻片固定在加熱蓋下的板上，就可以開(kāi)始實(shí)驗(yàn)了。需要考慮的重要事項(xiàng)是顯微鏡的放大倍率、系統(tǒng)應(yīng)該多久拍照一次以及拍攝多長(zhǎng)時(shí)間。例如，由于Schwann細(xì)胞是快速移動(dòng)的細(xì)胞，因此使用比成纖維細(xì)胞更低的放大倍數(shù)是意義的，成纖維細(xì)胞的移動(dòng)速度要慢得多，遷移距離更短。我們使用cellSens Olympus Corporation軟件每10分鐘拍攝一張照片，持續(xù)至少10小時(shí)，這個(gè)是為與細(xì)胞速度和覆蓋距離相關(guān)的遷移實(shí)驗(yàn)的而做的良好設(shè)置。如果您對(duì)細(xì)胞如何移動(dòng)或?qū)厝徊煌氖挛锔信d趣，例如細(xì)胞如何吸收粒子，則縮短拍攝照片之間的時(shí)間可能是有意義的。

　　5、通過(guò)分析數(shù)據(jù)量化實(shí)驗(yàn)　　

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在我們的案例中，軟件呈現(xiàn)的。vsi 文件，我們通常會(huì)將這些文件轉(zhuǎn)換為。avi視頻和。tiff 圖像序列。然后，使用ImageJ，我們使用手動(dòng)跟蹤插件通過(guò)跟蹤并單擊每一幀中的單個(gè)單元格來(lái)跟蹤選定的單元格。每個(gè)單元格都有單獨(dú)的遷移路徑。然后，使用 ibidi Chemotaxis and Migration Tool評(píng)估結(jié)果，該工具可以計(jì)算平均速度、平均總距離和有效距離，以及每個(gè)單元格的方向性指數(shù)（見(jiàn)圖3）。

　　圖3：ibidi Chemotaxis和遷移工具插件的界面

　　最后，您可以從中獲得令人驚嘆的數(shù)據(jù)！